PRÀCTICA AL LABORATORI: EXTRACCIÓ DE L'ADN DE CÈL·LULES ANIMALS

OBJECTIUS:

L’objectiu d’aquesta pràctica és poder extreure ADN de les cèl·lules del fetge d’un pollastre i poder-les observar al microscopi. Al microscopi havíem d’intentar trobar un fragment de cadena d’ADN, distingint-lo de la resta de material que hi ha.

BASES TEÒRIQUES:

Abans de fer aquesta pràctica sabíem que l’ADN és una molècula de l’àcid nucleic en forma de doble cadena en hèlix. Aquesta molècula conté la informació genètica dels éssers vius i està formada per nucleòtids que s’enllacen formant les cadenes. Aquests nucleòtids estan formats per tres elements: desoxirribosa (en el cas de l’ADN, perquè l’ARN té desoxirribosa) que és un polisacàrid; una molècula de fosfat, que enllaça nucleòtids; i una base nitrogenada. Aquesta base nitrogenada pot ser de quatre tipus: adenina (A), guanina (G), citosina (C) i timina(T). En el cas de l’ARN, en comptes de timina trobem uracil (U).

Aquests coneixements en ajuden en la pràctica en el següent:

Quan trenquem les cèl·lules amb el minipimer, l’ADN queda lliure i començaria a reaccionar si no hi posessim la barreja tampó, que permet mantenir-lo sense reaccionar. En el cas que no l’haguessim posat, les proteïnes associades a l’ADN s’haurien separat d’aquest amb l’acció del detergent i barrejat amb els altres elements que queden dispersos (ARN entre d’altres).

Amb el detergent, permetem que es trenca la cèl·lula i es permet que surti l’ADN i es barregi amb el tampó. Com que l’ADN està barrejat amb la barreja tampó, hem d’utilitzar l’alcohol isoamílic per poder extreure l’ADN d’aquesta barreja tampó. Tot i així, aquest alcohol s’ha de posar amb molt de compte perquè quedi sobre la mostra, perquè sinò no serveix. Aquest alcohol actuarà quan pugem la vareta de vidre amb l’ADN ja enganxat a ella i eliminarà ls restes de tampó.

MATERIALS UTILITZATS:

Materials:

    -Fetge de pollastre (mostra)

    -Batedora

    - Nevera

    - Colador (paper de filtre o gasa)

    - Embut

    -Vasos de precipitats

    - Tubs d’assaig

    -Vareta de vidre

    -Pipeta

    -Tisores

Reactius:

    -Per al tampó:

      · Aigua destil·lada

      · NaCl

      · NaHCO3

      · Detergent

   -Alcohol isoamílic a 0ºC (3-metil 1-butanol) (isopentacol)

PROCEDIMENTS

Per començar cal preparar una dissolució tampó, és a dir, una mescla que conté concentracions relativament elevades d’un àcid dèbil i la seva base conjugada i que, com que les diferències d’acidesa i basicitat són constatns, té la propietat de mantenir estable el pH d’una dissolució quan hi afegim quantitats relativament petites d’àcids o bases fortes. En aquest cas, l’àcid serà l’ADN (àcid desoxiribonucleic) de les cèl·lules d’un fragment de fetge animal. D’aquesta manera, com que tenim un equilibri de pH, en afegir petites quantitats d’àcid, el pH es modifica molt poc. Aquesta solució amortidora l’hem de preparar amb :

                120 ml d’aigua destil·lada

                1,5 g de NaCl

                5 g de NaHCO₃

                   5 ml de detergent

A continuació, agafem un tros de fetge de pollastre i l’introduïm dins d’un vas gran de precipitats. Cal tallar amb unes tisores del laboratori a trossets petits la mostra per tal de facilitar la trituració.

Quan tenim la carn ben tallada, hi afegim aigua destil·lada, de manera que quedi un dit d’aigua per sobre la carn, i la triturem amb una batedora elèctrica. Aquest procés s’ha de realitzar en 3 o més intervals de 10 segons fins que aconseguim una mostra líquida d’un color vermellós. Amb el triturat, fem que es trenquin les cèl·lules de la carn i que quedin suspesos els orgànuls cel·lulars entre els quals hi ha l’ADN. Les cèl·lules que no s’han trencat, queden exposades a l’acció del detergent.

Seguidament, amb l’ajut d’una pipeta mil·limetrada extraiem 5ml del preparat triturat i ho aboquem a un vas de precipitats net. En aquest recipient també cal afegir 10ml de la solució amortidora freda, mitjançant una pipeta, i agitar vigorosament amb  vareta de vidre durant aproximadament 2 minuts.

Per facilitar el procediment, pot anar bé (no és imprescindible) separar els grumolls de teixit més grans del caldo molecular tot emprant un colador molt fi.

Arribat aquest punt, hem d’extreure amb una pipeta mil·limetrada 5ml de caldo molecular i abocar-los a un tub d’assaig. A continuació aspirem 10ml d’alcohol isoamílic refredat a 0ºC i els introduïm dins el tub d’una manera especial: cal que aquesta pràctica es dugui a terme el més lentament possible tot inclinant la pipeta plena, de manera que l’extrem pel qual surt el líquid estigui tocant completament la paret del tub i deixem que regalimi. Cal ser molt rigorosos en aquesta part perquè és important que es diferenciïn dues fases, la del triturat, que està format per molècules pesades en suspensió i, per tant, resta al fons amb un color vermellós, i la fase de l’alcohol isoamílic transparent i menys densa que queda per sobre. Si ho aboquéssim tot de cop i ràpidament esquitxaríem la fase triturada i obtindríem una barreja en comptes de fases completament separades i hauríem d’esperar a que les totes les partícules caiguessin al fons. Després, cal tapar el pot de l’alcohol perquè és un líquid molt volàtil. L’alcohol isoamílic serveix per estabilitzar la molècula d’ADN i evita que es trenqui.

Finalment, només resta introduir una vareta de vidre ben neta lentament fins just sota la separació entre l’alcohol i el tampó. Poc a poc, agitem la vareta endavant i endarrere per tal que les fibres més grans de 400 Å d’ADN una mica condensat( ADN+ les proteïnes histones) del nucli de les cèl·lules s’adhereixin a la superfície de la vareta. Quan ha passat un minut, retirem lentament la vareta tot travessant la capa d’alcohol i un cop fora del tub, observarem com en  l’extrem de la vareta hi ha les fibres que es presenten amb un aspecte de mucosa o cotó mullat.

Si tenim temps, podem fer un preparat per observar la mostra al microscopi: agafem un portaobjectes i hi estenem la mostra que conté la vareta. A continuació afegim una goteta d’un colorant taronja, el taronja d’acridina, i després d’uns minuts i ho cobrim amb un cobreobjectes, amb cura que no quedin bombolles d’aire. A continuació ja podem realitzar les observacions.

RESULTATS

Amb la realització d’aquesta pràctica hem aconseguit l’obtenció per a una posterior observació al microscopi òptic de l’escola de les fibres d’ADN de 400 Å. Aquest ADN presentava un aspecte de mucosa filamentós. Cal pensar que aquest ADN no era pur ja que un altre àcid que podia haver en el caldo molecular, barrejat entre tots els orgànuls, és l’ARN (àcid ribonucleic). Per tant, en treure la vareta del preparat, hem arrossegat fragments d’ARN.

Al microscopi hem observat aquestes fibres i hem pogut identificar amb claredat unes estructures amb continuïtat, denses i recargolades en forma de cordill que corresponen a l’estructura d’ADN unit a unes proteïnes, les histones, que fan que les cadenes d’ADN puguin estar més condensades per tal d’ocupar menys espai dins del nucli cel·lular.

CONCLUSIÓ I REFERÈNCIA AL MÈTODE “PROFESSIONAL”:

Aquesta tècnica d’extracció d’ADN és una pràctica senzilla i útil per familiaritzar-se amb els àcids nuclèics i per descobrir que podem observar i estudiar l’ADN com qualsevol altre component de la molècula.

Paral·lelament, treballar amb aquestes molècules ens permet comprovar que les tècniques professionals no són més que una ampliació del mètode treballat. La pràctica que hem dut a terme és un procediment imprescindible per a la majoria de laboratoris d’anàlisi ja que resulta la basa per dur a terme la PCR, és a dir, una tècnica ràpida i eficaç de duplicació de ADN per tal de poder treballar amb la molècula. 

En les tècniques “professionals”, el procediment és més extens i rigurós. El material utilitzat és més específic i concret, com per exemple la columna DNeasy. A més a més és tracta d’un mètode que substitueix tècniques de separació com la filtració, per tècniques més precises, com és la centrifugació que et permet separar els components de la mostra en funció de la seva densitat i permet que la separació sigui gairebé total.

Nosaltres hem utilitzat una solució tampó ( alcohol isoamílic) en canvi, en les tècniques de laboratori utilitzen com a mínim 5. Però, tot i les diferències evidents entre els dos mètodes, la idea i fonament és exactament el mateix.

És importantíssim aconseguir realitzar pràctiques d’aquest estil ja que t’apropen al món científic i et permeten coneixa’l com una realitat que es pot entendre i discutir no com una veritat absoluta que no podrem arribar a entendre.

L’ADN és doncs una molècula que es troba al nucli de les cèl·lules eucariotes i es pot arribar a aïllar i observar al microscopi mitjançant una tècnica ràpida i fàcil de comprendre.